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Cytométrie en flux

Principe

Dans un petit volume d'échantillon contenant peu de cellules et des populations hétérogènes, la cytométrie en flux permet d'analyser, avec une grande sensibilité, la taille de la cellule, son contenu et l'intensité de fluorescence des cellules marquées.
Bien que dans la plupart des cas en immunophénotypage, les cytomètres sont principalement utilisés pour différencier les cellules positives à un marquage des cellules négatives, Biocytex utilise ce même instrument pour quantifier des molécules liées aux cellules, des récepteurs de surface, des ligands ou même des cibles intra-cellulaires.

 

Comment fonctionne la cytométrie en flux quantitative ?

La cytométrie en flux quantitative est réalisée en comparant l'intensité de fluorescence de l'échantillon biologique à un calibrant standard.
BioCytex utilise des calibrants composés de différentes populations de billes de même taille.
Ces billes de calibration sont recouvertes de quantités connues et croissantes d'immunoglobulines (IgG) et miment la fixation d’un anticorps monoclonal sur les cellules de l'échantillon biologique.
Puis ce calibrant et les cellules cibles immuno-marquées sont incubés en parallèle avec un anticorps polyclonal conjugué au FITC.


Les billes de calibration portent des nombres de sites définis et permettent de tracer une droite de calibration reliant l'intensité de fluorescence au nombre de récepteurs par cellule. La moyenne de fluorescence de l'échantillon testé est reportée sur la droite de calibration pour déterminer le nombre de molécules exprimées à la surface de la cellule. Le marquage non spécifique est évalué en utilisant un anticorps irrelevant (contrôle isotypique négatif).

 

 

 

Détermination des valeurs quantitatives

Les paramètres critiques pour maîtriser la quantification antigénique :

  • Atteindre la saturation des sites antigéniques en utilisant des anticorps monoclonaux IgG adéquates.
  • Utiliser des contrôles isotypiques appropriés pour évaluer les marquages spécifiques, notamment dans le cas de faible intensité de signal.
  • Utiliser des billes qui miment les cellules portant différents niveaux d'anticorps. Ces billes doivent être de même taille et porter la même auto-fluorescence que les cellules d'intérêt.
  • Calibrer la réponse de fluorescence de l'instrument.
  • Standardiser et calibrer la capacité de fixation de l'anticorps. Même au sein d'un même cluster de différenciation (CD), plusieurs anticorps monoclonaux peuvent donner des nombres de sites antigéniques différents puisqu'ils reconnaissent des épitopes différents.
  • Enfin, les conditions pré-analytiques doivent être établies et contrôlées pour chaque application.

Ces exigences ont poussé BioCytex au développement de trousses incluant tous les réactifs, non seulement les billes de calibration mais aussi les anticorps monoclonaux, les tampons, les agonistes et le protocole détaillé.

Les produits de Biocytex peuvent se dispatcher dans les catégories suivantes :

  • Monitoring de drogues (PLT VASP/P2Y12, PLATELET GpIIb/IIIa Occupancy)
  • Risque thrombotique (CELLQUANT PNH, REDQUANT PNH, PLT VASP/P2Y12, PLATELET GpIIb/IIIa Occupancy)
  • Maladies hémorragiques (PLT HPA-1, PLT Gp/Receptors, PLATELET PAIg, PLATELET Gp Screen, PLT VASP/P2Y12)
  • Biologie Vasculaire (CY-QUANT ELISA sCD146, Megamix)
  • Trousse personnalisable (PLATELET Calibrator, CELLQUANT Calibrator)

Pourquoi utiliser la technologie de cytométrie en flux quantitative de BioCytex?

De nombreuses molécules biologiques présentent un intérêt quant à la mesure de leur niveau d'expression. En effet, toute modulation du niveau d'expression des récepteurs lié à une différenciation physiologique, un état pathologique ou un traitement thérapeutique apporte des informations précieuses aux biologistes et aux cliniciens.
De telles mesures en biologie clinique nécessite une entière fiabilité en terme de reproductibilité de jour à jour, entre instruments et inter laboratoires.
Par exemple; un patient traité en ambulatoire par les nouvelles molécules anti-plaquettaires sera facilement suivi n'importe où il voyage.

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